bakteriologická diagnóza. Smernice. Bakteriologická diagnostika týfusu a paratýfusu A, B a C Bakteriologická laboratórna diagnostika

Metóda kultúrneho výskumu je izolácia zo živného média baktérií určitého typu kultiváciou s ich následnou druhovou identifikáciou. Typ baktérií sa určuje s prihliadnutím na ich štruktúru, kultúrne a environmentálne údaje, ako aj genetické, biochemické a biologické ukazovatele. Na bakteriologickú diagnostiku sa používajú schémy, ktoré schvaľuje ministerstvo zdravotníctva.

Nové druhy baktérií odvodené od živného média, ktorých vlastnosti ešte neboli stanovené, sú tzv čistá kultúra. Po konečnej identifikácii ich vlastností dostanú baktérie pochádzajúce z určitého miesta a v určitom čase meno. kmeň. V tomto prípade je povolený mierny rozdiel vo vlastnostiach, mieste alebo čase izolácie kmeňa jedného druhu.

Účel metódy:

1. Etiologická diagnostika, to znamená izolácia a identifikácia čistej kultúry baktérií.

2. Stanovenie počtu mikroorganizmov a ich špeciálnych vlastností. Napríklad špecifická reakcia na antibiotiká.

3. Identifikácia intragenerických rozdielov mikroorganizmov na základe ich epidemiologickej a genetickej zložky. Je to potrebné na určenie zhody mikroorganizmov izolovaných na rôznych miestach a rozdielne podmienkyčo je dôležité pre epidemiologické účely.

Táto výskumná metóda má určitý počet fáz, ktoré sa líšia pre aeróbne, fakultatívne a obligátne aeróbne baktérie.

Šľachtenie čistej kultúry pre aeróbne a fakultatívne aeróbne baktérie.

1. fáza

ALE) Prípravné činnosti . Táto fáza zahŕňa zber, skladovanie a prepravu materiálu. V prípade potreby môže byť tiež spracovaný v závislosti od vlastností študovaných baktérií. Napríklad pri skúmaní materiálu na tuberkulózu sa na identifikáciu mikrobaktérií odolných voči kyselinám používajú alkalické alebo kyslé roztoky.

b) Obohacovanie. Táto fáza je voliteľná a vykonáva sa, ak počet baktérií v testovanom materiáli nestačí na vykonanie plnohodnotnej štúdie. Napríklad pri izolácii krvnej kultúry sa testovaná krv umiestni do média v pomere 1 ku 10 a uchováva sa jeden deň pri teplote 37 °C.

IN) Mikroskopia. Náter testovaného materiálu sa farbí a skúma sa pod mikroskopom - skúma sa mikroflóra, jej vlastnosti a množstvo. V budúcnosti je potrebné z primárneho náteru oddelene izolovať všetky mikroorganizmy v ňom.

G) Vytváranie samostatných kolónií. Materiál sa nanáša na pohár so špeciálnym selektívnym médiom, na to sa používa slučka alebo špachtľa. Potom postavte pohár hore dnom, aby ste chránili kolónie pred kondenzáciou, a uložte do termostatu na približne 20 hodín pri udržiavaní teploty 37 o.

Dôležité! Malo by sa pamätať na to, že v procese výskumu je potrebné dodržiavať pravidlá izolácie. Na jednej strane na ochranu testovaného materiálu a odstraňovaných baktérií a na druhej strane na zabránenie kontaminácii okolitých osôb a vonkajšieho prostredia.

Pokiaľ ide o podmienene patogénne mikroorganizmy, pri ich odstránení záleží na ich kvantitatívnych charakteristikách. V tomto prípade sa uskutoční kvantitatívne naočkovanie, pri ktorom sa uskutoční niekoľko stonásobné zriedenie materiálu v izotonickom roztoku chloridu sodného. Potom sa výsev uskutoční do Petriho misiek s objemom 50 μl.

2. fáza

ALE ) Štúdia o morfologické vlastnosti kolónie v médiách a ich mikroskopia. Misky sa skúmajú a zaznamenávajú sa vlastnosti mikroorganizmov, ich počet, rýchlosť rastu a najvhodnejšie živné médium. Pre štúdium je najlepšie vybrať kolónie umiestnené bližšie k stredu a ak sa vytvorí niekoľko typov čistých kultúr, potom študovať každú samostatne.Na štúdium morfotypovej čistoty kultúry sa používa náter z kolónií, farbí sa (zvyčajne pomocou Gramovej metódy alebo akejkoľvek inej) a starostlivo mikroskopické.

b) Akumulácia čistej kultúry. K tomu sa kolónie všetkých morfotypov umiestnia do samostatných skúmaviek so živným médiom a udržiavajú sa v termostate pri určitej teplote (pre väčšinu mikroorganizmov je vhodná teplota 37 o, v niektorých prípadoch však môže byť iná).

Ako živná pôda na akumuláciu sa často používa Kliglerova pôda, v skúmavkách má „šikmý“ vzhľad, kde 2/3 jej častí sú v tvare stĺpca a 1/3 je skosený povrch, sfarbený do svetločervena . zloženie:

· MPA

· 0,1 % glukózy

· 1% laktózy

· Špeciálne činidlo pre sírovodík

· Fenolický červený indikátor.

3. fáza

ALE) Úroveň rastu a čistoty kultúry. Vo všeobecnom poradí má odvodená čistá kultúra rovnomerný rast a pri mikroskopickom skúmaní majú bunky rovnakú morfologickú a tinktoriálnu štruktúru. Existujú však niektoré typy baktérií s výrazným pleoforizmom, zatiaľ čo existujú bunky, ktoré majú inú morfologickú štruktúru.

Ak sa ako živné médium použilo Kliglerovo médium, potom sa biochemické charakteristiky určujú zmenou farby stĺpca a skosenej časti. Napríklad, ak sa laktóza rozkladá, skosená časť zožltne, ak glukóza - žltnutie stĺpca; pri produkcii sírovodíka dochádza k sčerneniu v dôsledku prechodu síranu na sulfid železa.

Ako môžete vidieť na obrázku, médium Kligler má tendenciu meniť svoju farbu. Je to spôsobené tým, že k rozkladu dusíkatých látok baktériami a tvorbe alkalických produktov dochádza nehomogénne ako v kolóne (anaeróbne podmienky), tak aj na šikmej ploche (aeróbne podmienky).

V aeróbnom prostredí (šikmý povrch) sa pozoruje aktívnejšia tvorba alkálií ako v anaeróbnom prostredí (stĺpec). Preto pri rozklade glukózy sa kyselina na šikmej ploche ľahko neutralizuje. Ale pri rozklade laktózy, ktorej koncentrácia je oveľa vyššia, sa kyselina nedá neutralizovať.

Čo sa týka anaeróbneho prostredia, vzniká veľmi málo alkalických produktov, takže tu môžete pozorovať, ako prebieha fermentácia glukózy.

Ryža. Kliglerova živná pôda:

1 - počiatočné prostredie,

2 - rast E. coli

3 - rast S. paratyphi B,

4 - rast S. Typhi.

E.coli- podporuje rozklad glukózy a laktózy s tvorbou plynov, neprodukuje vodík . Spôsobuje žltnutie celého média s diskontinuitami.

S. paratyphi - podporuje rozklad glukózy s tvorbou plynov, laktóza-neg. Skosená časť nemení farbu, stĺpik zožltne.
S. paratyphi A- neprodukuje sírovodík.
S. paratyphi B - vzniká sírovodík (pri injekcii sa objaví čierna farba).

S. typhi - glukóza sa rozkladá bez tvorby plynov, vzniká sírovodík, odpudzujúci laktózu. Skosená časť nemení farbu, stĺpec zožltne a médium počas vstrekovania sčernie.

Shigella spp.- laktóza-negatívna, glukóza-pozitívna, sírovodík sa nevytvára. Stĺpec získa žltý odtieň a skosená časť zostane rovnaká.

b) Konečná identifikácia čistej kultúry a jej odpoveď na antibiotiká. V tomto štádiu sa študujú biochemické, biologické, sérologické a genetické vlastnosti kultúry.

Vo výskumnej praxi nie je potrebné študovať celú škálu vlastností mikroorganizmov. Na zistenie, či mikroorganizmy patria k určitému druhu, stačí použiť najjednoduchšie testy.

Bakteriologická metóda zahŕňa bakterioskopiu materiálu od pacienta, izoláciu čistej kultúry patogénu a jej identifikáciu so stanovením citlivosti na antibiotiká a chemoterapeutické lieky.

Výber materiálu na bakterioskopické vyšetrenie závisí od údajnej etiológie ochorenia, štádia ochorenia, berúc do úvahy jeho patogenézu, biologické vlastnosti patogénu a ďalšie faktory.
1. o infekčné choroby vyskytujúce sa pri bakteriémii (týfus, generalizované a septické formy salmonelózy); so sepsou akejkoľvek etiológie spôsobenou nielen pyogénnou kokovou mikroflórou, Pseudomonas aeruginosa, ale aj jej zriedkavejšími patogénmi (Serratia Salinaria, nefermentujúce baktérie, anaeróby, streptokok L-formy (Suknevova metóda) a iné mikroorganizmy), ktoré sa v nich uchyľujú prípady na plodiny na špeciálnych živných médiách. Je potrebné zdôrazniť, že úspešnosť frekvencie a spektra patogénov izolovaných z krvi a iných biologických tajomstiev pacienta závisí od erudície, zvedavosti, vytrvalosti a vytrvalosti pracovníkov bakteriologického laboratória.
2. Cerebrospinálny mok (hnisavá meningitída; tuberkulózna meningitída s dlhodobou kultiváciou (viac ako mesiac) na živných pôdach špeciálnych na izoláciu tuberkulóznych baktérií.
3. Spútum (akútny zápal pľúc a tracheobronchitída, tuberkulóza, čierny kašeľ, mor, zriedkavé formy brušný týfus(pneumotýfus), legionelóza, respiračná mykoplazmóza a chlamýdie).
4. Hlien, hnis z mandlí (streptokoková a stafylokoková tonzilitída).

5. Plak a hlien z mandlí, z hrdla a nosa, výtok zo spojoviek, pohlavných orgánov (záškrt).
6. Škrabanie z nosovej sliznice (lepra).
7. Výtok z nosa a orofaryngu (sinuitída, ozena, rinoskleróm).

8. Edematózna tekutina, kúsky postihnutých svalov, nekrotické tkanivá (anaeróbne infekcie); výtok z rany (botulizmus, v prípade potreby tetanus).
9. Punktát zo zväčšených lymfatických uzlín (tuberkulóza, toxoplazmóza).
10 Obsah karbunky a bodky z hnisavých lymfatických uzlín (mor, tularémia, septikopyémia, antrax).

Bakteriologické štúdie najmä nebezpečné infekcie(mor, tularémia, brucelóza, cholera (pri ktorých sa vyšetrujú iba výkaly (!)) sa vykonávajú v laboratóriách so špeciálnym režimom, ktoré vylučujú možnosť samoinfekcie svojich zamestnancov pri práci s bakteriálnymi kultúrami a šírenie patogénov mimo nich. laboratóriách.

Sérologické štúdie. Na kliniku boli zavedené o niečo neskôr ako bakteriologická metóda navrhnutá R. Kochom. V roku 1896 F. Vidal zistil, že do konca 1. týždňa choroby krvné sérum pacientov s brušným týfusom nadobudlo schopnosť aglutinovať bacila týfusu, pôvodcu týfusu ( pozitívna reakcia Vidal). S polymikrobiálnou etiológiou infekčných chorôb sa po objavení Vidala začali uchyľovať aj k určovaniu titrov sérových aglutinínov u viacerých typov baktérií izolovaných z patologického materiálu (autovidálna reakcia) a k riadeniu ich dynamiky v závislosti od štádia choroba. Najvyššie titre aglutinínov k jednému z typov izolovaných baktérií svedčia v prospech jeho väčšej etiologickej účasti na vzniku ochorenia.

Už na začiatku aplikácie Vidalovej reakcie na klinike bolo pozorované, že najviac ťažké formy napríklad brušný týfus sa môže vyskytnúť pri absencii aglutinínov v krvi ( negatívna reakcia Vidal), čo naznačuje relatívnu diagnostickú hodnotu tejto metódy tak pri brušnom týfuse, ako aj pri iných infekčných ochoreniach. Neskôr ju nahradili citlivejšie sérologické metódy. Ale prioritná hodnota Vidalovho objavu zostane navždy.

V súčasnosti na sérologickú diagnostiku bakteriálne infekcie citlivejšie metódy sa používajú pri adsorbovaní bakteriálneho antigénu na povrchu erytrocytov (erytrocyty diagnosticums1). Tak boli vyvinuté zásadne nové sérologické testy: priama (TPHA) a nepriama hemaglutinácia (RIHA). Široko sa využívajú na sérologickú diagnostiku mnohých bakteriálnych, vírusových a iných infekcií (týfus, salmonelóza, šigelóza, brucelóza, tularémia atď.). Precipitačná reakcia si zachováva svoju diagnostickú hodnotu pri niektorých ochoreniach (botulizmus a antrax – Ascoliho reakcia na jej diagnostiku u zvierat). V sérodiagnostike sa v súčasnosti široko používa reakcia fixácie komplementu (RCC), ktorú v roku 1901 navrhli francúzski výskumníci Bordet a Zhangu (syfilis, kvapavka, brucelóza, toxoplazmóza, tuberkulóza, lepra, sopľavka). RSK má najvyššia hodnota na sérodiagnostiku vírusové infekcie(chrípka, iné akútne respiračné vírusové infekcie, herpes, encefalitída, parotitis, ornitóza atď.), ako aj početná rickettsióza.

Bakteriologická metóda štúdia patologického materiálu na izoláciu a identifikáciu mykobaktérií zahŕňa 3 metódy: bakterioskopickú, kultúrnu a biologickú / R.V. Tkzova, 1983; I. I. Rumachik, 1987, 1993; A.S. Dončenko, 1989; Yu.Ya Kassich, 1990; A. Kh. Naimanov, 1993; L. P. Khodun, 1997/. Doba bakteriologického vyšetrenia by nemala presiahnuť 3 mesiace.

Vzhľadom na to, že makroskopické tuberkulózne zmeny v orgánoch a tkanivách hovädzieho dobytka spôsobuje pôvodca tuberkulózy hovädzieho dobytka, nemá zmysel skúmať takýto materiál bakteriologicky. Ak sa takýto materiál dostane do laboratória na výskum, vykoná sa komisionálna kontrola a vypracuje sa zákon. Materiál je zdravotne nezávadný.

Bakterioskopické (mikroskopické) vyšetrenie materiálu spočíva v tom, že sa z každého orgánu (alebo kúskov orgánu s podozrivými zmenami pri tuberkulóze) a lymfatickej uzliny dodanej na vyšetrenie vyrobia 2 odtlačkové stery, vysušia sa na vzduchu, zafixujú sa nad plameňom. alkoholová lampa, farbenie podľa Cyl-Nielsena a prezeranie zafarbených náterov pod mikroskopom s najmenej 50 zornými poľami v každom nátere. Z hmoty z jedného korpusu je potrebné pripraviť aspoň 20 nátierok-tlačov. Okrem toho sa zo suspenzie materiálu vysiateho na živné pôdy pripravujú nátery pre mikroskopiu.

Farbenie náterov podľa Ziehla-Neelsena je selektívne na detekciu mykobaktérií: na modrom pozadí zafarbených tkanív alebo vonkajšej mikroflóry sú mykobaktérie viditeľné ako červené, ružové alebo rubínovo-červené tyčinky. Najlepšie je prezerať šmuhy pod binokulárnym mikroskopom pri zväčšení 1,5 (dýza) x 7 (okulár) x 90 alebo 100 (objektív).

Metóda sa používa ako signál, keďže prítomnosť alebo neprítomnosť mykobaktérií v náteroch absolútne neovplyvňuje priebeh ďalšieho výskumu a ani pozitívny bakterioskopický záver nemá žiadny právny význam (okrem vtákov). Materiál je potrebné ďalej skúmať.

Laboratórna diagnóza tuberkulózy u vtákov sa považuje za stanovenú, ak sa z testovaného materiálu izoluje kultúra vtáčích mykobaktérií (z papagájov – ľudských alebo vtáčích druhov), pozitívny výsledok biotesty, ako aj pri detekcii mykobaktérií v náteroch z patologického materiálu pri mikroskopickom vyšetrení (bod 7.3.2. príručky).

Je potrebné dbať aj na to, že príprava náterov odtlačkov, ich fixácia a prezeranie si vyžaduje veľa času a je veľmi zriedkavé v nich odhaliť mykobaktérie, dokonca aj v náteroch zo suspenzie osiva. Preto, aby sme ušetrili pracovný čas a peniaze pri štúdiu materiálu zo zvierat, u ktorých nedošlo počas porážky k zmenám, je vhodné obmedziť sa na prípravu a prezeranie náterov len zo suspenzie materiálu vysiateho na živných pôdach. To nepovedie k poškodeniu pri diagnostike tuberkulózy, pretože štúdium materiálu pokračuje ďalej.

Okrem bežnej svetelnej mikroskopie možno použiť fluorescenčnú mikroskopiu. Nátery sa pripravujú rovnakým spôsobom, fixujú sa a farbia zmesou fluorochrómov. Zafarbené šmuhy sa prezerajú pod fluorescenčným mikroskopom. Metóda je citlivejšia, ale menej špecifická, a preto nie je veľmi prijateľná najmä v praktických laboratóriách.

Kultúrna izolácia mykobaktérií na živných médiách je jedným z dôležitých článkov laboratórnej diagnostiky tuberkulózy v súčasnom štádiu. Živné pôdy, na ktoré bol materiál zasiaty (pre 5 až 10 skúmaviek v súlade s pokynmi) v prvých 2 až 3 týždňoch, však spravidla čiastočne alebo úplne klíčia v dôsledku porušenia sterility počas očkovania. materiálu. Plodiny sa vyhadzujú práve v čase, keď je najpravdepodobnejší výskyt počiatočného rastu atypických mykobaktérií (nehovoriac o prejave počiatočného rastu pôvodcu tuberkulózy, ktorý sa prejavuje aj neskôr). V takýchto prípadoch mechanicky vypadáva kultivačná metóda izolácie mykobaktérií na živných pôdach. To je jeden z hlavných dôvodov na získanie negatívnych výsledkov pri bakteriologickom vyšetrení materiálu. V dôsledku toho, že po naočkovaní materiálu nedošlo k rastu kolónií mykobaktérií na živných médiách a laboratórne zvieratá zostali nažive 3 mesiace, štandardná odpoveď laboratórií je nasledovná: „Pôvodca tuberkulózy nie je izolovaný“ alebo „ Vyšetrenie materiálu na tuberkulózu je negatívne“. Na základe výsledkov štúdií nebola stanovená príčina reakcie dobytka na tuberkulín, čo vedie k ďalšiemu neodôvodnenému zabíjaniu značného počtu zvierat, ktoré reagovali na tuberkulín na farmách bez výskytu tuberkulózy hovädzieho dobytka, ktorá spôsobuje veľké ekonomické škody, narúša obrat a reprodukciu stáda.

Vzhľadom na uvedené je potrebné uprednostniť kultivačný spôsob izolácie mykobaktérií z materiálu na živných pôdach, ako najslabšieho článku bakteriologickej diagnostiky tuberkulózy v obvodných veterinárnych laboratóriách.

Pozitívne výsledky kultivačnej metódy izolácie mykobaktérií závisia najmä od dvoch okolností: od zvýšenia spoľahlivosti výsevu mykobaktérií z materiálu a od dodržania podmienok sterility pri práci v boxe.

Zvýšenie spoľahlivosti výsevu mykobaktérií z materiálu odobratého na štúdiu závisí predovšetkým od jeho kvalitatívneho výberu, predsejbovej úpravy a zvýšenia počtu skúmaviek média, na ktoré sa výsev vykonáva.

Hlavné podmienky, ktorých dodržiavanie pri výseve materiálu na živné médiá zaručuje rast kolónií mykobaktérií:

a) odobrať materiál na bakteriologické vyšetrenie zo zabitých zvierat, u ktorých nedošlo počas porážky k zmenám, oddelene z každého jatočného tela a každú vzorku (materiál z každého zvieraťa) naočkovať do 10-20 skúmaviek s médiom podľa nasledujúcej schémy:

Lymfatické uzliny hlavy (submandibulárne, hltanové);

Bronchiálne a mediastinálne lymfatické uzliny;

Mezenteriálne (mezenterické) lymfatické uzliny;

Iné lymfatické uzliny (ak existujú podozrivé oblasti);

Orgány (aj v prípade potreby).

Výsledkom je naočkovanie materiálu od jedného zvieraťa pre 30-50 skúmaviek média. Tým sa dosiahne 3- až 5-násobné zvýšenie spoľahlivosti výsevu mykobaktérií, keďže bez separácie vzoriek (podľa návodu) sa odporúča naočkovať materiál len na 5 až 10 skúmaviek média z dvoch hláv jednej farma.

b) Priamo pri bakteriologickej inokulácii materiálu vyrežte kúsky s narušenou morfologickou štruktúrou lymfatickej uzliny alebo orgánu (hyperplázia, indurácia, bodové a pruhované krvácanie a pod.). Okrem toho je potrebné vystrihnúť všetky zmenené oblasti. Ak je v jednej malte veľa materiálu podľa objemu, potom sa môže rozdeliť na dve.

c) Dôsledne dodržiavať metodiku práce, bez porušenia režimu spracovania a výsevu materiálu.

d) Pri homogenizácii materiálu najmä lymfatické uzliny, je potrebné použiť sterilný piesok alebo jemne rozbité sterilné sklo. Pre lepšiu extrakciu mykobaktérií z testovaného materiálu materiál čo najviac rozdrvte (na krémovú konzistenciu).

e) K homogenizovanému materiálu v mažiari pridajte soľný roztok v množstve potrebnom na naočkovanie suspenzie materiálu na živné médiá a na biotest (v priemere do 0,5 cm3 v jednej skúmavke a 1-2 cm3 pri subkutánnej infekcii jedno morča). Toto množstvo fyziologického roztoku je možné vypočítať vopred.

f) Kontrola úrody materiálu by sa mala vykonávať po 3, 5, 7, 10, 15 dňoch a potom raz týždenne.

g) Akákoľvek kolónia mikroorganizmov rastúca na médiu (typická alebo atypická, pigmentovaná alebo nepigmentovaná, slizovitá alebo suchá atď.) sa musí mikroskopovať so selektívnym farbením podľa Ziehl-Neelsena.

Pozornosť by sa mala venovať stupňu premytia materiálu od kyseliny (alebo zásady), ktorý sa používa na ošetrenie materiálu pred kontamináciou cudzou mikroflórou. Zvyšková kyselina bude vždy prítomná v suspenzii zo semenného materiálu, mala by sa však obmedziť na minimum. Indikátorom toho je obnovenie pôvodnej farby média na 2.-4. deň po zasiatí materiálu. Ak sa farba média neobnoví, indikuje to zvýšené množstvo zvyšková kyselina. Farba média nadobúda modrastý odtieň rôznej intenzity. Rast (predpokladaných) mykobaktérií sa v tomto prípade spomalí, prípadne nebude existovať vôbec, najmä pôvodca tuberkulózy, keďže je náročnejší na kultivačný režim. Zvyškové množstvo kyseliny pôsobí na mykobaktérie do určitej miery bakteriostaticky.

Na utesnenie skúmaviek po naočkovaní materiálu možno použiť bavlnené a bavlnené zátky s následným plnením parafínovými, bezgumovými a gumenými s vyrezanou šikmou drážkou, kortikálnymi a kovovými zátkami (uzávermi).

Pri určovaní druhovej príslušnosti izolovanej kultúry mykobaktérií je známych veľa (asi 300) rôznych testov: kultúrno-morfologické, biologické, biochemické, sérologické, stanovenie liekovej rezistencie atď. Vo veterinárnej praxi sa však používa ich minimum (pozri návod). Pre laboratóriá stačí stanoviť izolovanú kultúru mykobaktérií nasledujúce typy: hovädzie, ľudské a vtáčie, ktoré sa určuje biotestom a atypické mykobaktérie - rozdelené do skupín podľa Runyona (1959): I - fotochromogénne (tvoriace pigment vplyvom svetla), II - skotochromogénne (tvoriace pigment bez ohľadu na expozíciu na svetlo - a v tme a na svetle), III - nechromogénne (netvoria pigment) alebo sa nazývajú aj nepigmentované (sem patrí aj pôvodca vtáčej tuberkulózy), IV - rýchlo rastúce mykobaktérie a kyselinovzdorné saprofyty.

Na tento účel je celkom efektívne a ekonomicky opodstatnené študovať vlastnosti izolovanej kultúry podľa skrátenej schémy, v ktorej sa hlavná pozornosť venuje načasovaniu výskytu primárneho rastu kolónií, tvorbe pigmentu, kultúrno- morfologické a farbiace vlastnosti pri farbení Ziehl-Neelsen. Zvlášť významný je test na tvorbu kordu v primárnej alebo dokonca subkultúre v kombinácii s výsledkami biotestu. Na prípravu náterov z vyrastených kolónií je vhodné ich súčasne vyrobiť z kolónií aj zo zvyškov suspendovaných látok a kondenzátu, t.j. z tekutej časti na dne skúmavky.

Okrem toho majú pracovníci laboratória možnosť nielen vykonávať kontrolné porážky zvierat, ktoré reagovali na tuberkulín a odoberať vzorky materiálu na výskum, ale aj počas života zvierat odoberať vzorky na bakteriologický výskum (bronchiálny alebo nosový hlien, mlieko trus, moč, exsudát, krv atď.), ako aj vzorky krmiva, vody, predmetov z prostredia na izoláciu mykobaktérií a tým nepriamo dokazujú príčinu reakcie dobytka na tuberkulín. Pri výseve prídavného materiálu a vzoriek z objektov životného prostredia sa využívajú známe metódy koncentrovania mykobaktérií: sedimentácia, flotácia, flotácia-sedimentácia a iné.

Skrátená schéma diferenciácie mykobaktérií pomocou biotestu

20. Charakteristika bakteriologickej výskumnej metódy

Kultúrna (bakteriologická) výskumná metóda - súbor metód zameraných na izoláciu a identifikáciu čistých kultúr mikroorganizmov (baktérií) kultiváciou na živných pôdach.

Čistá kultúra je súbor mikroorganizmov rovnakého druhu. Najčastejšie sa čistá kultúra získa selekciou a kultiváciou izolovanej kolónie (potomstvo jednej mikrobiálnej bunky).

Kroky metódy:

1. Zber materiálu na výskum.

2. Izolácia čistej kultúry a jej identifikácia.

3. Záver.

Zber materiálu na výskum. Typ študovaného materiálu závisí od účelu štúdie (diagnóza - od pacienta; epidemiologická analýza - z prostredia, potravy, pacienta a (alebo) nosiča baktérií).

Izolácia čistej kultúry. Zahŕňa 3 alebo 4 fázy:

1. Výsev materiálu (po predbežnej mikroskopii) na misku s hustým živným médiom (najlepšie diferenciálne diagnostické alebo selektívne), aby sa získali izolované kolónie. Vyrába sa najčastejšie metódou mechanického oddeľovania. V niektorých prípadoch (napríklad krv) sa materiál vopred naočkuje do tekutého obohacovacieho média, po čom nasleduje subkultivácia na platni s agarovým médiom. Niekedy sa pred očkovaním uskutočňuje selektívne ošetrenie materiálu (berúc do úvahy vlastnosti izolovaného mikroorganizmu; napríklad ošetrenie kyselinou alebo zásadou na izoláciu rezistentných baktérií). Kultivované pri teplote 37°C počas 18-24 hodín. Doba kultivácie pre odlišné typy baktérie môžu kolísať.

2(3): a) štúdium kolónií na agarovej platni (kultúrne znaky), výber najtypickejších; b) príprava náterov z týchto kolónií s farbením (podľa Grama alebo iných metód); a) skríning zvyšku študovanej kolónie na akumulačnom médiu a pestovanie v termostate pri optimálnej teplote.

3(4). Štúdium čistoty kultúry získanej na akumulačnom médiu. S tým

účelom je pripraviť náter, škvrnu (zvyčajne podľa Grama), mikroskopicky študovať

morfologická a farebná homogenita (v rôznych zorných poliach).

4(5). Čistá identifikácia kultúry.

Záver. Podľa súhrnu znakov v porovnaní s vlastnosťami referenčných (typických) kmeňov sa uvádza typ mikroorganizmu izolovaného z materiálu.

Hodnotenie metódy:

výhody: relatívne vysoká citlivosť a presnosť, schopnosť určiť počet mikróbov v testovanom materiáli, ako aj citlivosť na antibiotiká; obmedzenia: relatívneho trvania, metóda je drahá.

21. Živné pôdy pre aeróby a anaeróby. Požiadavky na živné pôdy, klasifikácia.

Požiadavky:

médiá musia byť výživné

musí mať určité ph

musí byť izotonický, t.j. osmotický tlak v médiu musí byť rovnaký ako v bunke.

by mala byť vlhká a nie príliš tekutá

musí mať určitý redoxný potenciál

musí byť sterilný

musia byť jednotné, t.j. obsahujú konštantné množstvá jednotlivých zložiek.

Živné médiá možno rozdeliť:

A) Pôvod

1) prirodzená - prirodzená strava (mäso, mlieko, zemiaky);

2) umelé - špeciálne pripravené na pestovanie mikróbov: - médiá z prírodných produktov (mäsová voda, mäsovo-peptónový bujón (MPB), mäsovo-peptónový agar (MPA), - nemajúce konštantné zloženie; - syntetické živné médiá - roztoky prísne definované množstvá solí, aminokyselín, dusíkatých zásad, vitamínov v destilovanej vode – majú konštantné zloženie, využívajú sa na pestovanie mikroorganizmov a bunkových kultúr pri výrobe vakcín, imunitných sér a antibiotík;

B) Po dohode:

1) všeobecný účel (MPB, MPA) - rastie na nich väčšina mikróbov;

2) voliteľné - selektívne podporujú rast jedného typu mikróbov zo zmesi (napríklad agar so žĺtkom a soľou pre stafylokoky);

3) diferenciálne diagnostické – umožňujú odlíšiť jeden typ mikróbov vzhľadom prostredia od iných (napríklad Endo, Levin media pre črevnú skupinu mikróbov).

Okrem toho v závislosti od účely použitia V schéme izolácie čistých kultúr možno podľa účelu rozlíšiť nasledujúce médiá:

1) obohatenie - inhibuje rast mikróbov spojených s patogénom;

2) získať izolované kolónie;

3) akumulácia čistej kultúry;

B) Konzistencia:

1) kvapalina;

2) polokvapalné (s prídavkom agar-agaru v koncentrácii 0,5-0,7 %);

3) hustá - nad 1%.

4.2. BIOLOGICKÉ A MIKROBIOLOGICKÉ FAKTORY

Bakteriologická diagnostika brušného týfusu a paratýfusu A, B a C

Dátum zavedenia: od momentu schválenia

1. VYVINUTÉ: FGUN Petrohrad NIIEM ich. Pasteur z Rospotrebnadzor (L.A. Kaftyreva, Z.N. Matveeva, G.F. Trifonova); GOUVPO „Štát Petrohrad lekárska akadémia ich. I.I. Mechnikov“ z Federálnej agentúry pre zdravie a sociálny rozvoj (A.G. Boytsov).

3. SCHVÁLENÉ vedúcim Federálnej služby pre dohľad nad ochranou práv spotrebiteľov a ľudským blahobytom, hlavným štátnym sanitárom Ruská federácia G.G.Onishchenko 29. decembra 2007 0100/13745-07-34

4. ZAVEDENÉ od momentu schválenia.

5. PRVÝ KRÁT PREDSTAVENÉ.

1 oblasť použitia

1 oblasť použitia

1.1. Smernice stanovujú základné princípy a znaky bakteriologickej diagnostiky brušného týfusu a paratýfusu A, B a C; obsahuje moderné informácie o biologických vlastnostiach patogénov, rezistencii na antibakteriálne liečivá, živných médiách na ich izoláciu a vlastnostiach diferenciácie týfusových a paratýfových patogénov od iných sérologických variantov Salmonella.

2. Zoznam skratiek

ABP - antibakteriálny liek

BCA - bizmut sulfitový agar

MPU - liečebno-preventívne zariadenie

MIC - minimálna inhibičná koncentrácia

P - stredná

U - stabilný

H - citlivý

RIF - imunofluorescenčná reakcia

CNS – centrálny nervový systém

V tabuľkách:

"+" - pozitívna reakcia v prvý deň;

"-" - negatívna reakcia počas 4-20 dní;

"(+)" - oneskorená pozitívna reakcia počas 2-20 dní;

d - rôzne enzymatické reakcie.

Je možná diferenciácia na enzymatické varianty.

3. Všeobecné ustanovenia

3.1. Brušný týfus a paratýfus A, B a C sú antroponotické črevné infekcie spôsobené Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi A, Salmonella Paratyphi B a Salmonella Paratyphi C. zriedkavo - paratýfus C.

3.2. Choroby sú charakterizované ulceratívnymi léziami lymfatický systém tenké črevo, bakteriémia, horúčka, cykl klinický priebeh s ťažkou intoxikáciou, roseolóznou vyrážkou na koži trupu, hepato- a splenomegáliou. Zápcha je bežnejšia ako hnačka. Ulcerácia Peyerových plátov ilea asi v 1 % prípadov vedie k črevné krvácanie a perforácia čreva s najnepriaznivejšími následkami pre pacienta.

3.3. Diagnóza brušného týfusu a paratýfusu A, B a C sa stanovuje na základe klinických príznakov ochorenia s prihliadnutím na epidemiologickú anamnézu a údaje z komplexného laboratórneho vyšetrenia, ktoré zahŕňa klasické bakteriologické a sérologické metódy. Bakteriologická diagnostika má prioritný význam, pretože V tomto prípade je možné získať najviac úplné informácie o biologických vlastnostiach patogénu vrátane jeho citlivosti na antibakteriálne lieky.

3.4. Použitie antimikrobiálnych liekov na etiotropnú terapiu brušného týfusu a paratýfusu na jednej strane znížilo úmrtnosť z 10-20% na menej ako 1% a na druhej strane skomplikovalo laboratórnu diagnostiku, pretože. často sa odber vzoriek materiálu na laboratórny výskum vykonáva po začatí antibiotickej terapie. Táto skutočnosť si vyžaduje starostlivejšie pristupovať k otázke výberu materiálu na výskum, preberania skúmaného materiálu a výskumných techník.

3.5. Modernou črtou epidemiológie brušného týfusu je prudký nárast frekvencie zavlečenia (prenášania) infekcie z území endemických pre túto chorobu, krajín blízkeho a vzdialeného zahraničia, ako aj infekcie ruských obyvateľov pri odchode do týchto krajín a v procese migrácie v rámci krajiny. Ďalším znakom je prítomnosť veľkého kontingentu vysokého epidemiologického rizika v podobe osôb bez trvalého bydliska, medzi ktorými je zaznamenaný vysoký výskyt brušného týfusu.

3.6. Tieto usmernenia boli vypracované s cieľom zjednotiť metódy bakteriologickej diagnostiky brušného týfusu a paratýfusu A, B a C, ako aj správnej interpretácie výsledkov laboratórnej štúdie s prihliadnutím na moderné funkcie klinikách, liečbe a epidemiologickej situácii v konkrétnych oblastiach.

4. Indikácie pre bakteriologickú diagnostiku

Indikáciou pre bakteriologické vyšetrenie biologického materiálu na prítomnosť patogénov týfusu a paratýfu A, B a C je potreba vyšetrenia:

4.1) pacienti s podozrením na brušný týfus, ako aj s horúčkou neznámej etiológie, trvajúcou 5 alebo viac dní;

4.2) osoby, ktoré boli v kontakte s pacientmi s brušným týfusom a paratýfusom A, B, C;

4.3) zamestnanci určitých profesií, odvetví a organizácií pri prijatí do práce a podľa epidemiologických indikácií;

4.4) osoby pred prijatím do nemocníc a špecializovaných sanatórií podľa klinických a epidemiologických indikácií;

4.5) osoby pri registrácii na nemocničné ošetrenie do nemocníc (oddelení) psycho-neurologického (psychosomatického) profilu, domovov seniorov, internátov pre ľudí s chronickým duševným ochorením a léziami CNS, do iných typov uzavretých ústavov s nepretržitou prevádzkou;

4.6) pacienti s brušným týfusom a paratýfusom po vymiznutí klinických príznakov ochorenia pred prepustením z nemocnice;

4.7) osoby, ktoré počas dispenzárneho pozorovania ochoreli na brušný týfus a paratýfus;

4.8) chronických bakteriálnych nosičov identifikovaných medzi zamestnancami určitých profesií, odvetví a organizácií pri opätovnom zamestnaní v týchto podnikoch a zariadeniach;

4.9) rezový materiál v prípade podozrenia na brušný týfus a paratýfus.

5. Logistika metódy

5.1. Štandardné testovacie a pomocné zariadenia, meracie prístroje pre mikrobiologické laboratóriá.

5.2. Živné pôdy, diagnostické séra a chemické reagencie na kultiváciu, izoláciu, identifikáciu a stanovenie citlivosti pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C na antibakteriálne liečivá.

5.3. Na laboratórnu diagnostiku týfusu a paratýfusu a detekciu nosičov baktérií by sa mali používať živné pôdy a činidlá schválené na použitie na území Ruskej federácie v súlade so stanoveným postupom.

6. Laboratórna diagnostika týfusu a paratýfu

6.1. Princíp bakteriologickej metódy je založený na detekcii živých mikroorganizmov v rôznych biologických substrátoch (krv, moč, stolica, žlč, kostná dreň, roseola) v závislosti od štádia ochorenia. Na tento účel sa vysieva určité množstvo biologického materiálu na špeciálne živné pôdy, nasleduje inkubácia v termostate a identifikácia vyrastených kolónií mikroorganizmov charakteristických pre S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B a S. Paratyphi. C, podľa kultúrnych a enzymatických vlastností a antigénnych charakteristík.

6.2. Iba bakteriologická štúdia môže poskytnúť presnú etiologickú diagnózu a kontrolu uvoľňovania tela z patogénu. Vo vzťahu odlišná diagnóza brušný týfus a paratýfus, jedinou metódou je laboratórne štúdium biologického materiálu s izoláciou patogénu a jeho identifikáciou na úroveň sérologického variantu, tk. klinický priebeh infekčného procesu nie vždy umožňuje rozlíšiť medzi týmito nosologickými formami.

7. Bakteriologické vyšetrenie

7.1. Izolácia pôvodcov týfusu a paratýfusov A, B a C sa uskutočňuje podľa rovnakej schémy bakteriologického vyšetrenia biomateriálov.

7.2. Postup pri zbere materiálu pre laboratórny výskum SP 3.1.1.2137-06 bola stanovená pre týfus a paratýfus.

7.3. Technika zberu a transportu biomateriálov do mikrobiologických laboratórií je popísaná v MU 4.2.2039-05.

7.4. Materiály na bakteriologické vyšetrenie na účely diagnostiky týfusu a paratýfusu sú:

krv;

výlučky;

moč;


Patogény možno izolovať aj z:

roseol;

kostná dreň;

materské mlieko.

Materiálom pre bakteriologický výskum na identifikáciu nosičov baktérií podľa SP 3.1.1.2137-06 sú:

výlučky;

moč;

žlč (obsah dvanástnika).

7.5. Štúdium prierezového materiálu sa vykonáva s cieľom objasniť diagnózu.

7.6. Odber biologického materiálu na laboratórny výskum sa vykonáva pred začiatkom etiotropnej liečby: zdravotnícky pracovník ktorí mali podozrenie na týfus-paratýfus; v prípade skupinovej a ohniskovej chorobnosti - odborníkmi inštitúcií Rospotrebnadzor a personálom zdravotníckych zariadení. Od hospitalizovaných pacientov sa na urgentnom príjme nemocnice odoberá materiál na bakteriologické vyšetrenie.

7.7. Od osôb, ktoré komunikovali s pacientmi alebo dopravcami (kontakty), odber materiálu vykonávajú zdravotnícki pracovníci zdravotníckych zariadení a iných organizácií a inštitúcií na mieste zistenia pacientov.

7.8. Biomateriál na laboratórny výskum je sprevádzaný špeciálnym smerom. Doručovanie materiálu samotnými subjektmi nie je povolené. Ak nie je možné včas dodať materiál, použijú sa konzervačné prostriedky a transportné médiá (tabuľka 1).

8. Bakteriologický krvný test

Indikáciou na vyšetrenie krvi je podozrenie na týfus-paratýfus alebo horúčkovitý stav neznámeho pôvodu (horúčka neznámeho pôvodu) pozorované 5 alebo viac dní (SP 3.1.1.2137-06).

Pomer krv - živná pôda by mal byť 1:10-1:60. Počet samostatne odobratých vzoriek krvi a čas ich odberu určuje ošetrujúci lekár podľa MU 4.2.2039-05 pre horúčku neznámeho pôvodu alebo podľa MU 04-723/3 MZ ZSSR ( 1984) pre podozrenie na týfus-paratýfus. U pacientov, ktorí dostávajú antibakteriálne lieky, vzorky sa musia odobrať bezprostredne pred zavedením (prijatím) ďalšej dávky lieku.

V prítomnosti horúčky je optimálne odoberať krv na pozadí zvýšenia telesnej teploty (nie však na vrchole teploty!). Výsev na živných pôdach sa vykonáva priamo pri lôžku pacienta.

Pri podozrení na týfus-paratýfus je možné na hemokultúru použiť Rapoport médium, 20% žlčový bujón, mäsovo-peptónový bujón s prídavkom 1% glukózy (v 100 ml fľaštičkách). Predtým používané hemokultúry v sterilnej destilovanej (kohútikovej) vode. Je však vhodnejšie použiť špeciálne kultivačné médiá krvi.

Množstvo krvi zasiate vo výške horúčky môže byť 10 ml, neskôr - až 20 ml (u detí - až 5 ml).

Pri horúčke neznámeho pôvodu trvajúcej viac ako 5 dní je spravidla potrebné vyšetriť niekoľko vzoriek krvi. Odber krvi zo žily sa vykonáva podľa MU 4.2.2039-05. Je to nevyhnutné na odlíšenie skutočnej bakteriémie od náhodnej kontaminácie krvi počas venepunkcie (pravdepodobnosť kontaminácie vzorky v dôsledku náhodného prepichnutia mazovej alebo potnej žľazy je 3 %). V tomto prípade sa na hemokultúru používajú dve médiá: 1) médium pre aeróby a fakultatívne anaeróby a 2) médium pre obligátne anaeróby (napríklad „dvojité“ médium + tioglykolové médium podľa nariadenia ministerstva zdravotníctva ZSSR zo dňa 12.04.85 N 535) alebo univerzálne médium pre aeróby a anaeróby.

Je vhodnejšie použiť priemyselne vyrábané médiá schválené na použitie v Rusku.

Plodiny sa inkubujú pri teplote 37 °C počas 10 dní s denným sledovaním. V tomto prípade sa fľaštičky s "dvojitým" médiom naklonia, čím sa premyje hustá časť média.

Pri absencii známok rastu na 10. deň sa vydá negatívna odpoveď.

Ak sa objavia známky rastu (zákal, začervenanie Rapoportovho média, objavenie sa viditeľných kolónií na hustej časti „dvojitého“ média), výsev sa uskutoční paralelne na polysacharidovom médiu a hustej pôde v Petriho miskách ( krvný agar v prípade horúčky neznámeho pôvodu a médium Endo v prípade podozrenia na týfusový paratýfus).

Priama inokulácia na polysacharidové médiá sa vykonáva na skrátenie času štúdie, pričom sa vychádza z predpokladu, že pri očkovaní krvi s vysokou pravdepodobnosťou bude pozorovaný rast monokultúry patogénu. Paralelné nanesenie na médium Endo alebo krvný agar je potrebné na kontrolu tohto predpokladu a na izoláciu čistej kultúry rozdelením jednotlivých kolónií.

Ak sa na týchto médiách pozoruje rast monokultúry, potom sa môžu vziať do úvahy biochemické vlastnosti polysacharidového média. Na kontrolu čistoty kultúry je potrebné vykonať mikroskopiu náteru z polysacharidového média zafarbeného Gramom. V tejto fáze je tiež možné nastaviť aglutináciu na skle s príslušnými aglutinačnými O- a H-salmonelovými sérami a vydať predbežnú odpoveď.

Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na brušný týfus a paratýfus je na obr.1.

Obr.1. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na týfus a paratýfus

Obr.1. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s podozrením na týfus a paratýfus

Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu je na obr.2.

Obr.2. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu

Obr.2. Schéma bakteriologického vyšetrenia krvi pacientov s horúčkou neznámeho pôvodu

Priebeh ďalšej identifikácie kultúry podľa kultúrno-morfologických, enzymatických vlastností a sérologických charakteristík je popísaný ďalej v príslušných častiach.

9. Bakteriologické vyšetrenie výkalov

Vzorky stolice sa odoberajú ihneď po defekácii z vydezinfikovanej a dôkladne umytej nádoby, na dno ktorej je položený hárok hrubého čistého papiera. Materiál sa odoberá pomocou lyžice-stierky namontovanej vo veku sterilnej nádoby. Pri absencii nádoby so špachtľou sa na odber materiálu používa akýkoľvek sterilný nástroj (sterilná drevená špachtľa, drôtená slučka, lyžica atď.). V prítomnosti patologických nečistôt je potrebné vybrať oblasti obsahujúce hlien, hnis, vločky, ale bez krvi. Vzorky tekutej stolice sa odoberajú pomocou sterilnej plastovej Pasteurovej pipety s uzavretým zásobníkom.

Objem odoberaného materiálu musí byť minimálne 2 g. Optimálnym materiálom je odber materiálu v prípade dekorovanej stoličky - v množstve vlašského orecha; kedy tekutá stolica jeho vrstva v nádobe by mala byť minimálne 1,5-2,0 cm Materiál umiestnený v sterilnej nádobe je dodaný do laboratória do 2 hodín.

Ak sa materiál nepodarí doručiť do laboratória do 2 hodín, odoberá sa do konzervačnej látky (prepravný systém s médiom). Objem materiálu nesmie presiahnuť objem média.

Stolica musí byť v médiu starostlivo homogenizovaná. Vzorky možno pred začiatkom štúdie uchovávať počas dňa v chladničke (4-6 °C).

Transportné médiá a konzervačné látky používané na izoláciu pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C, ako aj iných patogénov akútnych črevných infekcií, sú uvedené v tabuľke 1.

stôl 1

Transportné médiá a konzervačné látky najčastejšie používané na prepravu fekálií

Vzorky stolice odobraté priamo z konečníka pomocou rektálneho výteru slúžia predovšetkým na objektivizáciu diagnózy (MU 4.2.2039-05). Materiál odoberá zdravotnícky personál. Súčasťou transportného systému je spravidla špeciálna sonda na odber náteru. Je dôležité si uvedomiť, že prenikanie transportných médií na sliznicu konečníka je neprijateľné! Preto by mal byť rektálny tampón ponorený do transportného média až po odbere materiálu. Pacient je požiadaný, aby si ľahol na bok s bokmi pritiahnutými k žalúdku a zadkom od seba dlaňami. Tampónová sonda sa vloží do konečníka do hĺbky 4-5 cm a jemným otáčaním okolo osi sa odoberie materiál z krýpt konečníka. Opatrne vyberte tampónovú sondu a ponorte ju do transportného média. Preprava tampónu bez média nie je povolená.

V laboratóriu sa očkovanie vzoriek stolice uskutočňuje priamo na husté diferenciálne diagnostické živné pôdy a paralelne na obohacovacie médium.

Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov je na obr.3.

Obr.3. Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov

Obr.3. Schéma bakteriologického vyšetrenia výkalov

Z natívnych výkalov sa pripraví suspenzia v 0,9% roztoku chloridu sodného v pomere 1:5-1:10, nechá sa 30 minút, aby sa usadili veľké častice. Potom sa jedna kvapka supernatantu naočkuje do misiek s hustým živným médiom a 1 ml suspenzie sa naočkuje do obohacovacieho média (pomer materiálu a média by mal byť 1:5).

Výkaly dodané do laboratória v konzervačnom prostriedku (prepravné médium) sa musia pred očkovaním dôkladne zhomogenizovať v médiu, potom sa materiál priamo naočkuje na tuhé médium a obohacovacie médium v ​​rovnakých pomeroch ako natívne výkaly.

Vzorky stolice odobraté rektálnym tampónom sa vyšetrujú podobným spôsobom ako stolica dodávaná v konzervačnom prostriedku. Malo by sa pamätať na to, že rektálny tampón obsahuje menej mikroorganizmov v porovnaní s natívnou stolicou, preto je potrebné zvýšiť dávku inokula.

Maximálna detekcia S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B a S. Paratyphi C vo výkaloch sa dosahuje použitím obohacovacích médií, hoci u pacientov s akútne obdobie chorôb sa pôvodca často izoluje priamym výsevom. Inokulácia na obohacovacie médium súbežne s priamou inokuláciou je povinná!

Všetky očkovania sa inkubujú pri teplote 37 °C na diferenciálnych diagnostických médiách 18-24 hodín, na bizmutovo-sulfitovom agare 24-48 hodín. stredná). Kolónie charakteristické pre tieto patogény, pestované na hustom médiu, sa skrínujú na polysacharidovom médiu.

Je potrebné poznamenať, že technika nanášania materiálu na povrch platne s hustým médiom by mala zabezpečiť rast izolovaných kolónií typického typu, ktoré možno použiť na vizuálne posúdenie kultúrnych vlastností mikroorganizmu.

Preferovanou metódou na izoláciu S. Typhi je bizmutový sulfitový agar (BCA). Typické kolónie S. Typhi sú čierne a obklopené čiernym alebo hnedým okrajom s kovovým leskom. S. Typhi však často nevyvoláva charakteristické sčernanie ICA, keď dôjde k hojnému rastu, takže misky by sa mali naočkovať, aby sa umožnil rast jednej kolónie.

Vzorky výkalov možno naočkovať na štandardné selektívne médiá pre enterobaktérie schválené na použitie v Ruskej federácii. Výhodnou metódou na izoláciu S. tymhi je však agar bizmutitý siričitan. Priebeh ďalšej identifikácie kultúr podľa enzymatických vlastností a sérologických charakteristík je popísaný ďalej v príslušných častiach.

10. Bakteriologické vyšetrenie moču

Kultivácia moču sa vykonáva na diagnostiku od prvých dní ochorenia až do prepustenia pacienta, ako aj na identifikáciu bakterionosiča. Keďže týfus a paratýfus sa vylučujú močom pravidelne a na krátky čas, testy moču sa musia opakovať v intervaloch 5-7 dní.

Treba prísne dodržiavať všeobecné pravidlá odber moču stanovený v MU 4.2.2039-05. Bez ohľadu na spôsob získania moču je potrebné ho doručiť do laboratória do 2 hodín.V extrémnych prípadoch možno moč uchovávať aj cez noc v chladničke.

Malo by sa pamätať na to, že v závislosti od chemické zloženie močom, baktérie v ňom môžu počas skladovania odumrieť a aj sa množiť.

Zvýšenie trvanlivosti materiálu môže mimoriadne sťažiť interpretáciu výsledku.

Priama inokulácia moču (alebo sedimentu po odstredení) sa vykonáva bez predchádzajúceho obohatenia podľa nariadenia MZ ZSSR N 535 na hutné diferenciálne diagnostické médiá odporúčané pre salmonely vrátane patogénov týfusu a paratýfu. Súčasne sa natívny moč naočkuje do obohacovacieho média s dvojnásobnou koncentráciou v pomere 1:1 alebo sa močový sediment naočkuje do média s normálnou koncentráciou. Inokulácie sa umiestnia do termostatu pri 37 °C na 18-24 hodín a potom sa obohacovacie médium naočkuje na husté diferenciálne diagnostické médiá. Kolónie pestované na pevnom médiu sú identifikované kultivačnými, enzymatickými a sérologickými vlastnosťami.

11. Bakteriologické vyšetrenie žlče (obsah dvanástnika)

Žlč sa odoberá do troch sterilných skúmaviek alebo sterilných jednorazových nádob oddelene v častiach A, B, C podľa MU 4.2.2039-05 a dodáva sa do laboratória.

Vykonajte štúdiu každej dávky (A, B, C) samostatne alebo pripravte zmes troch dávok. Vzorky sa naočkujú:

na hutných diferenciálnych diagnostických médiách (ICA, Endo, EMS atď.) v množstve 0,5 ml;

v skúmavke (fľaške) so živným bujónom v pomere 1:10. Nie je potrebné očkovanie žlče na obohacovacie médiá, ako samotná žlč je dobrou živnou pôdou pre patogény týfusu a paratýfu.

Inokulované médiá sa inkubujú so zvyškami žlče pri 37 °C.

Po 18-24 hodinách sa skúmajú inokulácie na hustom živnom médiu (výsledky rastu na ICA sa berú do úvahy po 24 a 48 hodinách) a uskutoční sa opätovné vysiatie podozrivých kolónií na polysacharidové médium.

Z živného bujónu sa semená robia na hustých diferenciálnych diagnostických médiách.

Zo zvyšnej žlče v prípade negatívny výsledok priamy výsev sa opakuje na husté diferenciálne diagnostické médiá po 18-24 hodinách a na 3., 5., 7. a 10. deň.

Pestované mikroorganizmy sa identifikujú kultúrno-morfologickými, enzymatickými a sérologickými vlastnosťami.

12. Bakteriologické vyšetrenie materiálu z roseoly

Bakteriologické vyšetrenie ("škrabanie" roseolou) sa vykonáva v prítomnosti dobre definovanej roseoly. Materiál sa odoberá asepticky. Za týmto účelom je oblasť kože nad roseolou ošetrená 70% etylalkohol, potom utrite vatovým tampónom navlhčeným v sterilnom 0,9 % roztoku chloridu sodného a osušte sterilným tampónom.

Materiál na výskum (tkanivový mok) sa získava skarifikáciou pokožky nad roseolou skalpelom. 1-2 kvapky žlčového bujónu alebo izotonického roztoku chloridu sodného sa aplikujú na poškodenú kožu, zmiešajú sa s vyčnievajúcim tkanivovým mokom a odoberú sa Pasteurovou pipetou alebo podobným jednorazovým sterilným zariadením do skúmavky s jedným z tekutých obohacovacích médií (žlč bujón, Rapoport médium atď.). V laboratóriu sa očkovanie udržiava pri teplote 37 °C počas 18-24 hodín, po ktorom nasleduje očkovanie na husté diferenciálne diagnostické médiá (Endo, EMS, ICA).

13. Bakteriologické vyšetrenie kostnej drene

Je všeobecne známe, že v prípade laboratórneho potvrdenia diagnózy brušného týfusu je najúčinnejšie bakteriologické vyšetrenie kostnej drene (naočkovanosť patogénu je 90 – 95 %). Dokonca aj u pacientov s miernymi a vymazanými formami brušného týfusu, ktoré sú ťažké na klinické rozpoznanie, ako aj na pozadí užívania antimikrobiálnych liekov, je inokulácia myelokultúr výrazne vyššia ako hemokultúry.

V praxi sa však bakteriologické vyšetrenie kostnej drene vykonáva veľmi zriedkavo, iba pri zvláštnych príležitostiach. klinické indikácie, pri absencii iných laboratórnych údajov potvrdzujúcich diagnózu brušného týfusu alebo paratýfusu, tk. toto invazívny postup dosť traumatické. Odber vzoriek materiálu na výskum sa vykonáva iba v nemocnici za prítomnosti príslušného odborníka.

Materiál na bakteriologické vyšetrenie (aspirát) v množstve 0,50-0,75 ml sa získa asepticky prepichnutím hrudnej kosti (rúčka alebo telo) a naočkuje sa do skúmavky s jedným z obohacovacích médií (žlčový bujón, Rapoportovo médium a pod.).

Ak sa aspirát nedá naočkovať do obohacovacieho média ihneď po punkcii, odoberie sa do sterilnej skúmavky a ihneď sa odošle do laboratória, kde sa vykoná očkovanie do obohacovacieho média. V laboratóriu sa inokulácie inkubujú pri teplote 37 °C počas 18-24 hodín, po ktorých nasleduje inokulácia na husté diferenciálne diagnostické médiá.

Vykonáva sa ďalší výskum, ako pri bakteriologickom vyšetrení iného biologického materiálu.

14. Živné pôdy a činidlá

Zoznam kultivačných médií na izoláciu a identifikáciu patogénov črevné infekcie, najmä Enterobacteriaceae, je rozsiahly a neustále sa rozširuje. Výber konkrétnych prostredí je do značnej miery určený miestnymi ekonomickými podmienkami a tradíciami. Malo by sa však riadiť niekoľkými základnými zásadami.

14.1. Opis kultivačného média by mal uvádzať, že ho možno použiť nielen na detekciu Salmonella, ale aj Salmonella Typhi a S. Paratyphi A, B a C.

14.2. Dehydratované kultivačné médiá od renomovaných výrobcov by sa mali uprednostňovať pred médiami pripravenými priamo v laboratóriu.

14.3. Každá šarža kultivačného média v laboratóriu musí byť kontrolovaná testovacími kmeňmi (interná kontrola kvality).

14.4. Na laboratórnu diagnostiku týfusu a paratýfusu a detekciu nosičov baktérií by sa mali používať živné pôdy a činidlá schválené na použitie na území Ruskej federácie v súlade so stanoveným postupom.

15. Metódy štúdia enzymatických vlastností

V súčasnosti boli na štúdium enzymatickej aktivity mikroorganizmov z čeľade Enterobacteriaceae vrátane patogénov týfusu a paratýfu vyvinuté, vyrobené a registrované rôzne domáce a zahraničné diagnostické testovacie systémy (od najjednoduchších klasických Hiss médií v skúmavkách a platniach až po automatické analyzátory) . Ak testovacie systémy umožňujú identifikovať mikroorganizmus na úrovni rodu a identifikovať znaky enzymatickej aktivity kmeňov, možno ich použiť na identifikáciu patogénov týfusu a paratýfusu. Postup pri práci s testovacími systémami je podrobne popísaný v návode na použitie a mal by sa prísne dodržiavať.

16. Biologické vlastnosti patogénov

Pôvodcovia týfusu a paratýfusov A, B a C patria do čeľade Enterobacteriaceae, rod Salmonella, enterica species, poddruh I (enterica) a majú morfologické, kultúrne a enzymatické vlastnosti charakteristické pre tento poddruh, druh, rod a čeľaď.

U predstaviteľov rodu Salmonella species enterica sa historicky vyvinula situácia, kedy sa sérovary označovali nie antigénnym vzorcom ako u iných baktérií, ale názvami chorôb (ľudských alebo zvieracích), krajiny, mesta alebo ulice, kde boli izolované, atď. Je chybou uvažovať o názvoch týchto druhov, pretože nemajú taxonomický štatút. Názvy najbežnejších sérovarov Salmonella sú však také známe, že je takmer nemožné nahradiť ich antigénnymi vzorcami. Preto sa v modernej Kaufman-Whiteovej schéme pri označovaní Salmonella iba poddruhu I enterica namiesto druhového označenia používa názov sérovaru, ktorý sa však píše s veľkým písmenom.

Úplné názvy pôvodcov týfusu a paratýfusu sú teda nasledovné:

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Typhi;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi A;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi B;

Salmonella enterica subsp. enterica sérovar Paratyphi C

V bežnej praxi je možné použiť skrátené verzie názvov:

Salmonella sér. Typhi alebo Salmonella Typhi alebo S. Typhi;

Salmonella sér. Paratyphi A alebo Salmonella Paratyphi A alebo S. Paratyphi A;

Salmonella sér. Paratyphi B alebo Salmonella Paratyphi B alebo S. Paratyphi B;

Salmonella sér. Paratyphi C alebo Salmonella Paratyphi C alebo S. Paratyphi C

16.1. Kultúrne a morfologické vlastnosti

Mobilné gramnegatívne tyčinky netvoria spóry a kapsuly, fakultatívne anaeróby rastú dobre na bežných živných pôdach.

Na jednoduchom živnom agare - kolónie mierne konvexné s hladkým okrajom a hladkým povrchom, vlhké s leskom väčším ako 1 mm.

Na diferenciálnych diagnostických médiách (obsahujúcich laktózu ako rozlišovaciu látku) - priehľadné, bezfarebné alebo modrasté a niekedy ružovkasté alebo farby prostredia kolónie (Endo, Ploskirev, EMS a iné podobné médiá).

Na SS-arape stredne farebné kolónie s čiernym stredom.

Na bizmutovo-sulfitovom médiu sú izolované kolónie S. Typhi, S. Paratyphi B čierne s charakteristickým kovovým leskom, médium pod kolóniou je zafarbené na čierno. Kolónie S. Paratyphi A sú zelenkasté, svetlej farby média, jemné.

Kmene S. Paratyphi B (pôvodca paratýfusu B) na mäsovo-peptónovom agare môžu vytvárať zvýšenú mukoidnú stenu pozdĺž periférie kolónií. Pri skladovaní plodín pri izbovej teplote sa sliznica vyvíja 2-5 dní. Tento príznak nie je trvalý a diagnostický.

16.2. Enzymatické vlastnosti

Štúdium enzymatických vlastností sa uskutočňuje vo vzťahu k súboru uhľohydrátov, viacsýtnych alkoholov, aminokyselín a iných organických zlúčenín používaných pri identifikácii a štúdiu Salmonella a iných enterobaktérií. V praktických laboratóriách sa spravidla používa malý počet testov na identifikáciu hlavných rodov, ktoré sú súčasťou čeľade črevných baktérií. Charakteristiky enzymatických vlastností Salmonella, vrátane pôvodcov týfusu a paratýfusu A, B a C, sú uvedené v tabuľke 2.

tabuľka 2

Enzymatické vlastnosti patogénov brušného týfusu a paratýfusov A, B, C

Došlo k chybe

platba nebola dokončená z dôvodu technickej chyby, hotovosť z vášho účtu
neboli odpísané. Skúste počkať niekoľko minút a platbu zopakujte.