Transducția specifică în bacterii. Bacteriofagi, caracteristici structurale și aplicare practică. Caracteristicile fiziologiei bacteriilor anaerobe

Transducția specifică a fost descoperită în 1956 de M. Morse și soții lor E. și J. Lederberg. Trăsătură caracteristică Transducția specifică este că fiecare fag transductor transferă doar o anumită regiune, foarte limitată, a cromozomului bacterian. Dacă în transducția generalizată, fagul acționează ca un purtător „pasiv” al materialului genetic al bacteriilor, iar recombinarea genetică în bacteriile transduse are loc conform legilor generale ale procesului de recombinare, atunci în transducția specifică fagul nu numai că transferă materialul genetic, dar îi asigură şi includerea în cromozomul bacterian. Cel mai cunoscut exemplu de transducție specifică este transducția efectuată de fagul λ, care este capabil să infecteze celulele bacteriene E. coli cu integrarea ulterioară a ADN-ului său în genomul bacterian. Fagul temperat λ, în timpul lizogenizării bacteriilor ca urmare a recombinării site-specifice (ruperea și reuniunea încrucișată a catenelor de ADN), este integrat în cromozomul lor într-un singur loc: în zona dintre loci bio și gal. Această zonă se numește attλ. Excizia (excizia) profagului din cromozom în timpul inducției profage este, de asemenea, efectuată prin mecanismul recombinării specifice locului. Recombinarea specifică site-ului are loc cu acuratețe, dar nu fără erori. Aproximativ o dată la un milion de evenimente în timpul exciziei profage, recombinarea nu are loc în situsul attλ, ci implică regiunile gal sau bio. Se crede că acest lucru se datorează formării „incorecte” a unei bucle în timpul dezintegrarii profagelor. Ca rezultat, regiunea genomului bacterian adiacent profagului este scindată din cromozom și devine parte din genomul fagului liber. Regiunea genomului profag corespunzătoare locației sale în buclă rămâne în cromozomul bacterian. Astfel, se produce schimbul genetic între profet și cromozomul bacterian. Materialul genetic bacterian integrat în genomul fagului poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagului. După împachetarea ADN-ului fagic, din care o parte este înlocuită cu ADN bacterian, particulele de fagi defecte se formează în capul fagului. Fagul este defect din cauza faptului că volumul capului este limitat și atunci când un fragment de ADN bacterian este inclus în genomul său, o parte din genomul fagului rămâne în cromozomul bacterian. Dacă defectul este nesemnificativ, atunci fagul rămâne viabil, deoarece învelișul proteic rămâne intact și asigură adsorbția pe celule. Un astfel de fag defect poate infecta alte celule, dar nu poate provoca o infecție a reproducerii, deoarece genele responsabile de reproducere sunt absente. Dacă într-un astfel de fag defect ADN-ul păstrează capete lipicioase, asigurând transformarea lui într-o formă circulară, atunci ADN-ul fagului defect, împreună cu un fragment de ADN bacterian, poate fi integrat în ADN-ul bacteriilor primitoare și poate provoca lizogenizarea acestora. S-a descoperit că atunci când profagul λ este indus mai des se formează particule defecte care conțin gene ale locusului gal. Astfel de particule defecte sunt denumite λdgal (fag λ, defect, gal). Dacă genomul fagului λ conține o genă responsabilă pentru sinteza biotinei, atunci – λdbio. În consecință, dacă celulele receptoare bio– sau gal– sunt tratate cu fagolizatul obținut după infectarea bacteriilor donatoare cu fagul λ, care conține particule defecte, atunci se formează transductanți bio+ sau gal+ cu o frecvență de 10–5–10–6. Transducția specifică în E. coli este efectuată nu numai de fagul λ, ci și de fagii înrudiți, care sunt numiți fagi lambdoizi, care includ φ80, 434, 82 etc. În special, fagul φ80 este inclus în cromozomul din apropierea genelor. care codifică formarea enzimelor responsabile de sinteza triptofanului. Din acest motiv, fagul φ80 este potrivit pentru transferul genelor trp. S-a descoperit că fagul P22 al S. typhimurium, pe lângă transducția generală, poate efectua și transducția specifică. În timpul ciclului de dezvoltare litică, bacteriofagul P22 poate efectua transducția generală, iar în timpul lizogenizării, transducția specifică. ADN-ul fagului P22 este integrat într-o regiune a cromozomului lângă genele responsabile de sinteza prolinei. Integrarea profagului stimulează dramatic formarea unor particule transductoare specifice. Astfel, pentru a efectua transducția specifică, este necesară lizogenizarea preliminară a bacteriilor donatoare și inducerea ulterioară a profagului din celule. Particulele de fagi transductoare defecte rezultate infectează celulele tulpinii primitoare, ele sunt lizogenizate și profagul este inserat cu o porțiune din genomul bacteriei donatoare în cromozomul receptor. Transducția poate fi utilizată în următoarele direcții: transduce plasmidele și fragmentele scurte ale cromozomului donor; pentru construirea de tulpini ale unui genotip dat, în special tulpini izogenice. Aici, dimensiunea mică a fragmentelor transferate oferă un avantaj pentru transducție față de conjugare. Tulpinile izogenice construite folosind transducția generalizată diferă numai în regiunea cromozomială purtată de fagul transductor; pentru cartografierea precisă a genelor bacteriene, stabilirea ordinii și localizarea acestora în operoni și structură fină determinanți genetici individuali, care se efectuează folosind un test de completare. Se știe că sinteza unui anumit grup de produse necesită funcționarea mai multor gene. Să presupunem că sinteza unei enzime este determinată de produsele genelor a și b. Să fie doi mutanți fenotipic identici care sunt incapabili de sinteza enzimatică, dar nu se știe dacă sunt identici sau diferiți genetic. Pentru a identifica genotipul, se efectuează transducția, adică fagul este propagat pe celulele unei populații, iar apoi celulele celei de-a doua populații sunt infectate cu fagolizat. Dacă, la placare pe un mediu selectiv, se formează atât colonii mari de transductanți adevărați, cât și colonii mici de transductanți abortivi, se ajunge la concluzia că mutațiile sunt localizate în gene diferite.

Manualul este format din șapte părți. Partea întâi – „Microbiologie generală” – conține informații despre morfologia și fiziologia bacteriilor. Partea a doua este dedicată geneticii bacteriilor. Partea a treia – „Microflora biosferei” – examinează microflora mediu inconjurator, rolul său în ciclul substanțelor din natură, precum și microflora umană și semnificația acesteia. Partea a patra – „Studiul infecției” – este dedicată proprietăților patogene ale microorganismelor, rolului lor în procesul infecțios și conține, de asemenea, informații despre antibiotice și mecanismele lor de acțiune. Partea a cincea – „Doctrina imunității” – conține idei moderne despre imunitate. A șasea parte – „Virușii și bolile pe care le provoacă” – oferă informații despre proprietățile biologice de bază ale virușilor și despre bolile pe care le provoacă. Partea a șaptea - „Microbiologie medicală privată” - conține informații despre morfologia, fiziologia, proprietățile patogene ale agenților patogeni ai multor boli infecțioase, precum și despre metodele moderne de diagnosticare, prevenire și terapie specifică a acestora.

Manualul este destinat studenților, absolvenților și profesorilor de medicină superioară institutii de invatamant, universități, microbiologi de toate specialitățile și medici practicanți.

Ediția a V-a, revizuită și extinsă

Carte:

<<< Назад

Înainte >>>

Diferă de nespecific prin faptul că, în acest caz, fagii transductori transferă întotdeauna doar anumite gene, și anume, cele care sunt situate în cromozomul unei celule lizogene în stânga lui attL sau în dreapta attR. Transducția specifică este întotdeauna asociată cu integrarea unui fag temperat în cromozomul celulei gazdă. La ieșirea (excluzând) din cromozom, profagul poate captura o genă din flancul stâng sau drept, de exemplu, fie gal, fie bio. Dar, în acest caz, trebuie să-și piardă aceeași cantitate de ADN de la capătul opus, astfel încât lungimea sa totală să rămână neschimbată (altfel nu poate fi ambalată în capul fagului). Prin urmare, cu această formă de excludere se formează fagi defecte: ?dgal sau ?dbio.

Transducția specifică în E coli efectuate nu numai de fagul lambda, ci și de lambdoid și alți fagi înrudiți. În funcție de locația site-urilor attB de pe cromozom, atunci când sunt excluse, ele pot activa diverse gene bacteriene legate de profag și le pot transduce în alte celule. Materialul integrat în genom poate înlocui până la 1/3 din materialul genetic al fagului.

Când o celulă primitoare este infectată, un fag transductor se integrează în cromozomul său și introduce o nouă genă (o nouă trăsătură) în ea, mediand nu numai lizogenizarea, ci și conversia lizogenă.

Astfel, dacă în timpul transducției nespecifice fagul este doar un purtător pasiv al materialului genetic, atunci în timpul transducției specifice fagul include acest material în genomul său și îl transferă, lizogenând bacteriile, către receptor. Cu toate acestea, conversia lizogenă poate apărea și dacă genomul unui fag temperat conține propriile sale gene pe care celula nu le are, dar sunt responsabile pentru sinteza proteinelor esențiale. De exemplu, numai acei agenți patogeni ai difteriei care au un profag moderat care poartă operonul tox sunt integrați în cromozomii lor pentru a produce exotoxină. Este responsabil pentru sinteza toxinei difterice. Cu alte cuvinte, toxicitatea fagică temperată provoacă conversia lizogenă a unui bacil difteric netoxigen într-un bacil toxigen.

Metoda stratului de agar este următoarea. Mai întâi, un strat de agar nutritiv este turnat în ceașcă. După întărire, în acest strat se adaugă 2 ml de agar 0,7%, topit și răcit la 45 °C, la care se adaugă mai întâi o picătură dintr-o suspensie concentrată de bacterii și un anumit volum de suspensie de fagi. După ce stratul superior s-a întărit, cupa este plasată într-un termostat. Bacteriile se înmulțesc în interiorul stratului moale de agar, formând un fundal opac continuu, pe care coloniile de fagi sunt clar vizibile sub formă de pete sterile (Fig. 84, 2). Fiecare colonie este formată prin multiplicarea unui virion fag inițial. Utilizarea acestei metode permite: a) prin numărarea coloniilor, determinarea cu precizie a numărului de virioni fagi viabili dintr-un material dat;

b) de către trasaturi caracteristice(mărime, transparență etc.) studiază variabilitatea ereditară la fagi.

În funcție de spectrul acțiunii lor asupra bacteriilor, fagii sunt împărțiți în polivalent(bacteriile legate de liză, de exemplu, fagul polivalent Salmonella lizează aproape toate Salmonella), monofag(ele lizează bacteriile de un singur tip, de exemplu, fagul Vi-I lizează numai agenții patogeni febră tifoidă) Și specifice tipului fagi care lizează selectiv anumite variante de bacterii din cadrul unei specii. Cu ajutorul unor astfel de fagi, se realizează cea mai subtilă diferențiere a bacteriilor în cadrul unei specii, împărțindu-le în variante de fagi. De exemplu, folosind setul de fagi Vi-II, agentul cauzator al febrei tifoide este împărțit în mai mult de 100 de variante de fagi. Deoarece sensibilitatea bacteriilor la fagi este o trăsătură relativ stabilă asociată cu prezența receptorilor corespunzători, tiparea fagilor are o semnificație diagnostică și epidemiologică importantă.

Orez. 84. Detectarea bacteriofagelor în materialul de testat:

1 – test la fața locului; 2 – titrare după Grazia

<<< Назад

Înainte >>>

În transducția generală, particulele fagice care conțin segmente de ADN celulei gazdă transferă porțiuni relativ lungi de ADN genomic de la o celulă bacteriană la alta. Particulele de fagi transductoare se formează în timpul anumitor procese infecțioase atunci când ADN-ul celulei este degradat în mod eficient și se fragmentează.

ADN celular, aproximativ de dimensiunea genomului fagului, accidental ambalate în particule bacteriofage mature. Ca urmare a infecției ulterioare a celulelor bacteriene cu o populație de particule de fagi, inclusiv fagi transductori, cu ajutorul acestora din urmă, ADN-ul celulelor donatoare este transferat la aceste celule infectate. Recombinarea dintre fragmentele introduse de ADN donor și ADN-ul celulei primitoare duce la o modificare a genotipului acesteia din urmă.

Fiecare particulă de fag transductoare conține de obicei doar un fragment aleatoriu al cromozomului donor original. Probabilitatea includerii oricărei părți a genomului donor într-o astfel de particulă este aproximativ aceeași. Cu toate acestea, datorită dimensiunii destul de mari a segmentelor de ADN transduse (pentru anumiți bacteriofagi este de aproximativ 100 kb, sau 2,5 la sută din întregul cromozom E. coli), celula primitoare dobândește de obicei un întreg grup de gene într-un act de transducție. . Ca rezultat, genele strâns legate între ele pe cromozomul donor sunt cotransduse cu o frecvență înaltă, în timp ce genele îndepărtate unele de altele sunt transduse independent. Determinarea frecvenței cotransducției genelor ajută la rafinarea hărților genetice, permițând estimarea distanțelor relative dintre genele strâns legate. 3 Transducție specifică (limitată).

Transducția de al doilea tip, specifică, este caracteristică bacteriofagelor temperate, al căror ciclu infecțios este întrerupt ca urmare a includerii genomului viral într-un locus cromozomial specific al ADN-ului celulei infectate. Bacteriile care conțin astfel de genomi de fagi integrati sunt numite lizogenă. Ei poartă genomi virali ca elemente ereditare ale propriilor cromozomi. Într-o celulă lizogenă, genomul viral și cel celular se replic ca o singură unitate și sunt compatibile reciproc. Integrarea genomului fagului cu genomul celulei gazdă privează fagul de capacitatea de a provoca moartea celulelor și de a produce descendență infecțioasă. Din acest motiv, bacteriofagul

capabil de lizogeneză, spre deosebire de virulent fag, numit moderat.

Sub anumite conditii - inducţie- se întrerupe starea lizogenă și se decupează genomul viral din cromozomul gazdă. Se replic pentru a forma multe particule virale și ucide celula. De obicei, excizia genomului viral are loc foarte precis, iar fagul rezultat conține un genom viral care corespunde complet cu cel original.

Uneori, genomul fagului este tăiat incorect și genele cromozomiale sunt incluse în particulele fagilor fiice, adiacent la genomul viral integrat. Aceste gene sunt pornite în locul unor gene virale. În timpul următorului ciclu de infecție, genele celulei donatoare sunt transferate împreună cu genele fagilor în celulele primitoare. După ce ADN-ul fagului transducător este încorporat în genomul receptorului, celula dobândește, împreună cu genomul fagului, informațiile genetice ale gazdei fagice anterioare.

Astfel, în timpul transducției specifice, fagul servește ca un vector pentru transferul genelor de la o celulă la alta. Folosind acest mecanism, sunt transduse doar acele gene cromozomiale ale celulei gazdă care sunt strâns legate de locul de integrare al genomului viral.

Deoarece diferiți fagi temperați se introduc în diferite locuri cromozomiale, atunci când sunt excizati incorect, se produc fagi care transduc diferite gene cromozomiale. Deci fagi lambda transduc genele responsabile de metabolismul galactozei sau genele care controlează sinteza biotinei, iar fagii f80 transduc un număr diferit de gene care codifică enzime pentru biosinteza triptofanului.

Genomul fagului este capabil de transducție specifică cu condiția:

1 Trebuie să dobândească un segment covalent legat de ADN non-viral care va fi transdus. Acest segment de ADN este de obicei de origine celulară, dar în principiu poate fi din orice sursă. Poate fi introdus oriunde în genomul viral dacă este

nu afectează replicarea ADN-ului viral în celula gazdă infectată sau capacitatea acesteia de a fi împachetat în particule de fagi mature.

2 Genomul fagului trebuie să se poată replica după ce a avut loc infecția celulei primitoare, de exemplu. ADN-ul viral trebuie să păstreze originea regiunii de replicare (OP) și genele necesare pentru replicare.

3 Genele fagilor care codifică proteine fagice structurale trebuie să fie active funcțional.

Transducția specifică este utilizată pe scară largă în genetica moleculară. Să luăm în considerare un exemplu de astfel de aplicare a acestui fenomen. Gena E. coli care codifică sinteza enzimei beta-galactozidazei conține 3600 pb. și constituie o miime din genomul unui microorganism dat. Dacă un fragment de ADN al unei celule bacteriene care codifică sinteza beta-galactozidazei este inserat în genomul bacteriofagului transductor lambda, acesta ocupă o a cincisprezecea parte acolo, adică ADN-ul fagului lambda este îmbogățit cu gena beta-galactozidazei. De 100 de ori mai mult decât ADN-ul E. coli.

Transducția este transferul de gene de la o celulă bacteriană la alta folosind un bacteriofag. Acest fenomen a fost stabilit pentru prima dată în 1952 de către N. Zinder și J. Lederberg. Ei au efectuat cercetări asupra bacteriei Salmonella typhimurium, care este patogenă pentru șoareci. Au fost selectate două tulpini ale acestor bacterii: tulpină 22A, una auxotrofă, incapabilă de a sintetiza triptofan (T~) și tulpina 2A, capabilă să sintetizeze triptofan (T1"). Aceste tulpini au fost însămânțate într-un tub în formă de U, separate la partea inferioară printr-un filtru bacterian (Fig. 24 Tulpina 22A (T~) a fost inoculată într-un cot al tubului, iar tulpina 2A (T1") în celălalt. După o anumită perioadă de incubație, bacteriile din tulpina 22A, atunci când sunt semănate pe un mediu nutritiv minim, au produs un număr mic de colonii (frecvența de apariție a celulelor transduse a fost egală cu N0~5). Acest lucru a indicat că unele celule au dobândit capacitatea de a sintetiza triptofan. Cum ar putea bacteriile să dobândească această proprietate? Cercetare

Orez. 24. Schema experimentului asupra transducinei

a arătat că tulpina 22A a fost lizogenă pentru fagul P-22. Acest
fagul a fost eliberat din cultura lizogenă, trecut prin
filtru și tulpina lizată 2A. Prin alăturarea unei părți a geneticii
După ce a primit materialul de la tulpina 2A, fagul bacterian a revenit și a transferat acest material genetic la tulpina 22A. Tulpina 22A la
a dobândit proprietăți ereditare specifice ale tulpinii 2A,
în acest caz, capacitatea de a sintetiza triptofan. Alte trăsături pot fi transduse în mod similar, inclusiv capacitatea
la fermentație, rezistență la cantibiotice etc.

Fenomenul de transducție a fost stabilit și la Escherichia coli și actinomicete. De regulă, o genă este transdusă, mai rar două și foarte rar trei gene legate. Când materialul genetic este transferat, o secțiune a moleculei de ADN fag este înlocuită. Fagul își pierde apoi propriul fragment și devine defect. Includerea materialului genetic în cromozomul bacteriei primitoare se realizează printr-un mecanism precum crossing over. Are loc un schimb de material ereditar între regiunile omoloage ale cromozomului receptor și materialul introdus de fag.

Există trei tipuri de transducție: generală sau nespecifică, specifică și abortivă. În timpul transducției nespecifice, în timpul asamblarii particulelor de fagi, oricare dintre fragmentele de ADN ale bacteriei afectate pot fi incluse în capetele lor împreună cu ADN-ul fagilor. Ca rezultat, diferite gene din bacteria donatoare pot fi transferate la celulele primitoare. Transducția nespecifică poate fi efectuată de fagii P-1 și P-22 în Escherichia, Shigella și Salmonella. În timpul transducției specifice, profagul este introdus într-un anumit loc pe cromozomul bacterian și transduce anumite gene situate în cromozomul celulei donatoare de lângă profag. De exemplu, fagul „k (lambda) în starea profag este întotdeauna inclus în același loc în cromozomul E. coli și transduce locusul care determină capacitatea de a fermenta galactoza. Când profagii sunt separati de ADN-ul gazdei, genele bacteriene. adiacente profagului sunt eliminate din compoziție împreună cu cromozomul acestuia, iar o parte din genele profagelor rămân în compoziția sa.Frecvența transducției generale variază de la 1 la 1 milion la 1 la 100 de milioane.Transducția specifică are loc mai des.

S-a stabilit că un fragment din cromozomul donatorului transferat în celula primitorului nu este întotdeauna inclus în cromozomul primitorului, dar poate fi păstrat în citoplasma celulei. Când bacteriile se divid, ajung în doar una dintre celulele fiice. Această condiție se numește transducție abortivă.

Transducția specifică

b) studiază variabilitatea ereditară la fagi pe baza trăsăturilor caracteristice (mărime, transparență etc.).

În funcție de spectrul acțiunii lor asupra bacteriilor, fagii sunt împărțiți în polivalent(bacteriile legate de liză, de exemplu, fagul polivalent Salmonella lizează aproape toate Salmonella), monofag(ele lizează bacteriile de un singur tip, de exemplu, fagul Vi-I lizează doar agenții cauzali ai febrei tifoide) și specifice tipului fagi care lizează selectiv anumite variante de bacterii din cadrul unei specii. Cu ajutorul unor astfel de fagi, se realizează cea mai subtilă diferențiere a bacteriilor în cadrul unei specii, împărțindu-le în variante de fagi. De exemplu, folosind setul de fagi Vi-II, agentul cauzator al febrei tifoide este împărțit în mai mult de 100 de variante de fagi. Deoarece sensibilitatea bacteriilor la fagi este o trăsătură relativ stabilă asociată cu prezența receptorilor corespunzători, tiparea fagilor are o semnificație diagnostică și epidemiologică importantă.