Реакция связывания комплемента. Описание, применение. Микробиология с техникой микробиологических исследований - реакция связывания комплемента При положительной рск в опыте наблюдается

(РСК) - серол. реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих Ат и Аг. Принцип РСК состоит в том, что специфический иммунный комплекс полностью или частично адсорбирует добавленный в систему С. В качестве количественного индикатора связывания С берут гемолитическую систему, гемолиз к-рой указывает на отсутствие иммунного комплекса в диагностической системе (отрицательная РСК), задержка гемолиза - на присутствие иммунного комплекса (положительная РСК). В РСК применяют: 1) прогретую при 57 °С 30 мин иссл. с-ку, она должна быть свежей, без взвешенных частиц, цитотоксинов, С. В опыт обычно берут несколько кратных 2 разведении с-ки в зависимости от диагностического титра РСК при предполагаемом заболевании; 2) диагностикум продажный или специально приготовленный для РСК; 3) С в рабочей дозе, к-рая при титровании с Аг равна титру С, а при титровании без Аг - выше титра С на 20 - 25%; 4) эритроциты барана отмывают несколько раз физраствором и готовят 3% взвесь; 5) гемолитическую с-ку разводят в 3 раза меньше титра, указанного на этикетке. Все 5 компонентов берут в одинаковом объеме (0,5 мл или 0,25 мл). В опытную (диагностическую) систему вводят иссл. с-ку, диагностикум, С. Готовят контроли: с-ки - с-ку, С и физраствор (вместо Аг); диагностикума -диагностикум, С и физраствор (вместо с-ки); С- С и двойной объем физраствора; заведомо положительный -стандартная иммунная с-ка, Аг, С; заведомо отрицательный - нормальная с-ка, Аг, С. Пробирки встряхивают и ставят в термостат при 37 °С на 45 мин. Одновременно заготавливают гемолитическую систему, смешивая равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической с-ки, и инкубируют ее в термостате такое же время. После сенсибилизации во все опытные и контрольные пробирки добавляют двойной объем гемолитической системы (1 мл или 0,5 мл). Все пробирки выдерживают в термостате при 37°С до появления полного гемолиза в контрольных пробирках (около 30 - 40 мин). При количественном способе постановки реакции находят разведение, в к-ром имеется задержка гемолиза не менее чем на 2+ (титр Ат иссл. с-ки) и сравнивают его с диагностическим титром распознаваемой болезни. Полуколичественный способ с одним разведением с-ки (обычно 1:5) дает возможность определить степень задержки гемолиза на 4+, 3+, 2+ и, исходя из этого, оценить интенсивность реакции. Более точные результаты представляет нахождение титра с-ки не по 100%, а по 50% гемолизу (см. Комплемента определение). Предложен вариант количественной постановки РСК, в к-ром берут одно разведение с-ки, но несколько доз С (1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4). Все остальные компоненты используют в таких же количествах. При оценке имеют в виду то обстоятельство, что чем больше доз С связывает иссл. с-ка, тем больше в ней Ат.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "Реакция связывания комплемента" в других словарях:

реакция связывания комплемента - РСК Лабораторный метод. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РСК EN complement fixation testCFTCF test … Справочник технического переводчика

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА - реакция связывания комплемента, РСК, реакция Борде—Жангу [по имени бельг. бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса… … Ветеринарный энциклопедический словарь

I Реакция связывания комплемента серологическая реакция, используемая для определения антигена или антитела, основанная на оценке потребления (связывания) комплемента комплексами антиген антитело, см. Иммунологические методы исследования. II… … Медицинская энциклопедия

реакция связывания комплемента

реакция связывания комплемента - (РСК), высокочувствительная и специфическая серологическая реакция, применяемая для диагностики многих инфекционных и инвазионных болезней животных. Состоит из двух последовательных фаз. В первой фазе антиген смешивают с испытуемой сывороткой и… … Сельское хозяйство. Большой энциклопедический словарь

- (РСК; син.: Борде Жангу реакция, реакция отклонения комплемента устар., реакция фиксации алексина устар.) метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген антитело связывать комплемент, что выявляется… … Большой медицинский словарь

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) - высокочувствительная и специфич. серологич. реакция, применяемая для диагностики мн. инфекц. и инвазионных болезней ж ных. Состоит из двух последоват. фаз. В первой фазе антиген смешивают с испытуемой сывороткой и комплементом (комплекс белков… … Сельско-хозяйственный энциклопедический словарь

- (устар.) см. Реакция связывания комплемента … Большой медицинский словарь

реакция отклонения комплемента - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

См. Реакция связывания комплемента. (

Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний, а также составляет основу некоторых других методов выявления противовирусных антител. Хотя реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ превосходят реакцию связывания комплемента по чувствительности, однако простота методики, раннее обнаружение антител, а также выявление вирусных антигенов, не обладающих гемагглютинирующими свойствами, объясняют ее широкое применение в вирусологических исследованиях.

Для ее постановки не требуется такая высокая степень концентрации и чистоты антигенных препаратов, которые необходимы для ряда других иммунологических реакций. Кроме того, групповая специфичность комплементсвязывающих антигенов многих вирусов позволяет использовать реакцию связывания комплемента при массовой диагностике: эта реакция не выявляет штаммовых различий, приобретает особую ценность при изучении антигенных взаимосвязей между вирусами.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных реакций. На первом этапе в реакции участвуют антигены и антитела (один из этих компонентов заранее известен), а также комплемент в оттитрованном количестве. При соответствии антигена и антител их комплекс связывает комплемент, что выявляется на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антител, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция связывания комплемента). При отрицательной реакция связывания комплемента несвязанный комплемент способствует гемолизу, по которому судят о результатах реакции.

Основными компонентами реакции связывания комплемента служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2-7,4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результат реакции.

Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также культуральной жидкости после культивирования вирусов в тканевых культурах клеток. В антигенных препаратах всегда содержится много балластных веществ из клеток животных или культур ткани, что может также исказить результаты реакции.

Полученные вирусные антигены инактивируют, определяют рабочую дозу, а также антикомплементарные и гемолитические свойства. После этого антиген титруют в присутствии комплемента.

Вторым основным компонентом при постановке реакции является комплемент. Этим термином обозначают сложную систему белков и факторов, присутствующих в крови животных и человека. Обычно в реакции связывания комплемента применяют сыворотку крови морских свинок. Активность (титр) комплемента - это его наименьшее количество, в присутствии которого гемолизин вызывает полный гемолиз используемой гемолитической системы.

Для выявления комплемент-связывающих антител к вирусам проводят обязательную инактивацию сыворотки для устранения комплемента при 560С в течение 30 мин. В качестве референс-сывороток обычно используют сыворотки иммунизированных животных. Причем для иммунизации применяют вирусные антигены, тщательно очищенные от тканевых примесей, так как к противном случае возникает выраженная неспецифическая реакция.

Обязательным компонентом реакции связывания комплемента является гемолитическая система, в которую входят эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана.

Для постановки реакции связывания комплемента используют следующие модификации: микрометод реакции связывания комплемента в микротитраторе системы Такачи, реакцию длительного связывания комплемента, реакцию непрямого связывания комплемента, реакцию связывания комплемента в геле, реакцию связывания комплемента микрокапельным методом, реакцию связывания комплемента на твердой основе.

Хотя чувствительность реакции связывания комплемента невысокая, однако она имеет высокую специфичность. В этой связи она широко применяется для диагностики вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

Реакция связывания комплемента (РСК) – это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело:

первая – специфическая;

вторая – индикаторная (гемолитическая).

Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.

Специфическое взаимодействие антигена и антитела сопровождается связыванием комплемента. Образовавшийся комплекс визуально не проявляется. В качестве индикатора используется гемолитическая система. Гемолитическая сыворотка сенсибилизирует эритроциты к действию комплемента, в присутствии которого происходит лизис эритроцитов (гемолез). Если гемолиза нет, значит комплемент связан первой системой, и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу – положительный ответ. Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой, вызывая гемолиз – реакция отрицательная.

Для постановки РСК все ингредиенты реакции подготавливают и титруют до проведения основного опыта.

Сыворотку (больного или диагностическую) накануне проведения реакции прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Некоторые сыворотки, особенно иммунизированных животных, обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность устраняют путем обработки их углекислым газом, прогреванием при температуре 57-58ºС, однократным замораживанием при температуре -20ºС или -70ºС и удалением осодка центрифугированием, добавлением к сыворотке комплемента в объеме 1:10 сыворотки и прогреванием ее после инкубации на холоде в течение 18-20 ч. Для предотвращения антикомплементарности сывороток их хранят в лиофилизированном виде или замороженном состоянии при низких температурах.

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганиз мов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вируссодержащие материалы. Многие антигены из микроорганизмов получают производственным путем. Антикомплементарность антигенов устраняют при помощи таких методов, как термолиз (многократное замораживание и оттаивание), обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами (метанолом, этанолом) и т.д.

В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом; можно также применять сухой комплемент. Чтобы получить основной роаствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоноческим раствором натрия хлорида.

Эритроциты барана используют в виде 3 взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стерильную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза изотоническим раствором натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. Эритроциты можно хранить 5-6 дней при температуре 4-6ºС. Срок хранения эритроцитов увеличивается при их консервировании с формалином.

Гемолитическую сыворотку для РСК получают следующим образом Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50% взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Если титр сыворотки не ниже 1:1200, то делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при температуре 56ºС. Для предупреждения бактериального пророста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10000 или 1 борную кислоту).

Гемолитическая система состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 30 мин.

Титрование гемолитической сыворотки. Сыворотку титруют путем соединения 0,5 мл ее (в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и т.д.) с 0,5 мл 3 взвеси эритроцитов и 0,5 мл свежего комплемента в разведении 1:10. Объем смеси для реакции в контрольных пробирках доводят до 1,5 мл, добавляя изотонический раствор натрия хлорида. Результаты реакции учитывают через 1 ч инкубации при температуре 37ºС. Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз. Хранят сыворотку в лиофилизированном виде.

Схема титрования гемолитической сыворотки

Титрование комплемента. Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента.

Для опыта берут рабочую дозу комплемента (содержащуюся в объеме 0,5 мл), которая выше титра на 20-30%.

Схема титрования комплемента

Термостат при температуре 37ºС в течение 45 мин

Термостат при температуре 37ºС в течение 30 мин

Титрование антигена. Антигены, используемые для РСК могут адсорбировать какое-то количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Поэтому перед проведением опыта антигены титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. В меньшей степени антикомплементарные свойства выражены у специфических антигенов, выпускаемых производственным путем. Их титр определяют не перед каждым опытом, а один раз в месяц, учитывая возможность его уменьшения в процессе хранения.

Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающемся количестве от 0,5 до 0,05 мл, доводя объем в них до 1 мл путем добавления раствора натрия хлорида. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37ºС. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, снова выдерживают их в течение 1 ч в термостате и учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз. Для РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-1/3 титра. Антигены, в присутствии которых титр комплемента уменьшается более чем на 30%, непригодны для реакции.

Схема титрования антигена

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.

Схема проведения основного опыта РСК

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.

При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).

Предложен ряд модификаций РСК, отличающихся повышенной чувствительностью и меньшим объемом используемых ингредиентов. Так, например, при вирусологических исследованиях объем ингредиентов для РСК на холоде – 1 мл. Для капельной РСК берут 1 каплю сыворотки + 1 каплю антигена + 1 каплю комплемента + 2 капли гемолитической системы.

Реакция связывания комплимента нашла самое широкое распространение в микробиологической и серологической диагностике.

С помощью РСК обнаруживают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови больных сифилисом, сапом, хронической гонореей, риккетсиозами, вирусными заболеваниями и др.

Особый интерес РСК представляет для клинической иммунологии. Реакцию применяют для выделения различных субпопуляций лимфоцитов, для выявления антигенов HLA на тромбоцитах, перевиваемых лимфобластах, фибробластах, опухолевых клетках и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих антител.

реа́кция свя́зывания комплеме́нта , РСК, реакция Борде—Жангу [по имени бельг. бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген—антитело фиксировать свободный комплемент (), применяемая при диагностике многих бактериальных и вирусных и некоторых протозойных и гельминтозных болезней, а также для изучения процессов, сопровождающихся изменением количества антигена или антител. РСК протекает в 2 фазы: 1) взаимодействие антител, антигена и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом антиген—антитело (специфическая фаза); 2) индикация реакции сенсибилизированной эритроцитами (неспецифическая фаза). В РСК используют 2 системы: специфическую бактериологическую, состоящую из антитела (испытуемой сыворотки), антигена и комплемента, а также неспецифическую «индикаторную», содержащую гемолизин (гемолитическая сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. Антиген соединяется с антителом только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит антитела, гомологичные взятому антигену, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом антиген — антитело и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, то есть без комплемента гемолизин (гемолитическое антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между антигеном и антителами испытуемой сыворотки нет специфического родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитической системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная). Существуют различные варианты постановки РСК: классический метод постановки в виде макро- и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количественной РСК по 50%-ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. В ветеринарной диагностической практике чаще применяют классический метод РСК в виде макроварианта, при котором берут каждого компонента по 0,5 или 0,25 мл в определённом рабочем титре. Комплемент титруют в бактериологической системе на сыворотках того же вида животных, кровь которых подлежит исследованию. Испытуемые сыворотки обычно исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Время связывания комплемента в специфической фазе 20 мин, время реакции гемолиза в неспецифической фазе 20 мин при t 37—38ºC. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод — РДСК. При этом первую фазу реакции проводят при t 4—6ºC в течение 16—18 ч, что ведёт к усилению адсорбции комплемента малыми количествами антигена и антител. Затем добавляют гемолитическую систему и реакция протекает при t 37—38ºC в течение 20 мин. Результаты РСК и РДСК учитывают по степени задержки гемолиза, которую обозначают крестами или минусом, соответствующими следующим процентам гемолиза эритроцитов: ++++ от 0 до 10%; +++ от 10 до 40%; ++ от 40 до 70%; + от 70 до 90%; – от 90 до 100%. Ветеринарным законодательством предусмотрены специальные наставления по постановке, учёту и оценке РСК и РДСК для каждой болезни отдельно.

Литература:
Лабораторные исследования в ветеринарии, М., 1971;
Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. Х. Ходжаева, М., 1973.

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Смотреть что такое "" в других словарях:

Реакция связывания комплемента - (РСК) серол. реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих Ат и Аг. Принцип РСК состоит в том, что специфический иммунный комплекс полностью или частично адсорбирует добавленный в систему С. В качестве… … Словарь микробиологии

реакция связывания комплемента - РСК Лабораторный метод. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РСК EN complement fixation testCFTCF test … Справочник технического переводчика

Реакция связывания комплемента - I Реакция связывания комплемента серологическая реакция, используемая для определения антигена или антитела, основанная на оценке потребления (связывания) комплемента комплексами антиген антитело, см. Иммунологические методы исследования. II… … Медицинская энциклопедия

реакция связывания комплемента - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… …

реакция связывания комплемента - (РСК), высокочувствительная и специфическая серологическая реакция, применяемая для диагностики многих инфекционных и инвазионных болезней животных. Состоит из двух последовательных фаз. В первой фазе антиген смешивают с испытуемой сывороткой и… … Сельское хозяйство. Большой энциклопедический словарь

реакция связывания комплемента - (РСК; син.: Борде Жангу реакция, реакция отклонения комплемента устар., реакция фиксации алексина устар.) метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген антитело связывать комплемент, что выявляется… … Большой медицинский словарь - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Комплемента связывания реакция - см. Реакция связывания комплемента. (

Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.